Cellules souches hépatiques, MSC et biothérapies du foie.
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Le groupe « Différenciation des cellules souches hépatiques, MSC et biothérapie hépatique » provient de l'ex unité U632, dirigée par le Dr Patrick Maurel (http://www.montp.inserm.fr/u632/).
Notre travail, basé sur un modèle original de cultures primaires d'hépatocytes humains adultes (HHP) et d'autres types cellulaires du foie, aborde in vitro plusieurs aspects de la physiopathologie hépatique : fonction de détoxication du foie, métabolisme, infection par le virus de l'hépatite C, et différenciation de cellules souches/progéniteurs vers l’hépatocyte. Il combine une recherche à la fois fondamentale et translationnelle. 
Culture primaire d’hépatocytes humains.
Les hépatocytes humains sont classiquement isolés par une méthode de perfusion à la collagènase en deux étapes, soit à partir de foies de donneurs d'organes réfutés pour la transplantation, soit à partir de résections hépatiques réalisées pour différentes raisons médicales (métastases, carcinome hépatocellulaire ou autres pathologies). Dans ce dernier cas, le tissu entourant la tumeur est disséqué et envoyé pour les études anatomo-pathologiques, tandis que le tissu encapsulé restant en aval, considéré comme « normal », est utilisé pour la préparation des hépatocytes et des autres types cellulaires du foie. Nous avons établi des conditions expérimentales de culture en monocouche permettant de maintenir ces cellules dans un état différencié pendant au moins un mois.
Résumé de l’activité scientifique
1. Activités utilisant les cultures primaires d’hépatocytes humains adultes La culture primaire d’hépatocytes est considérée comme le modèle cellulaire de référence pour les études de physiopathologie du foie humain. Détoxification et réactions croisées des récepteurs nucléaires Le modèle des HHP a été largement exploité dans le laboratoire pour étudier le métabolisme des xénobiotiques et des médicaments, leurs effets secondaires et toxiques, et la régulation des gènes codant pour les enzymes de detoxification, avec notamment la mise en évidence de réactions croisées entre les récepteurs nucléaires impliqués (AhR : Aryl Hydrocarbon receptor, PXR : pregnane X receptor et CAR : constitutive androstane receptor) et d'autres voies de signalisation, et leur conséquence clinique. Par exemple, l’interférence fonctionnelle entre le xenoreceptor PXR, le récepteur de l'hormone thyroïdienne (TR) et la synthèse des acides gras établit un lien moléculaire entre les xénobiotiques et la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), fréquemment observée chez les patients placés sous traitement chronique avec des agonistes de PXR. Infection par le virus de l'hépatite C L’infection par le virus de l’hépatite C (VHC) touche 3% de la population mondiale et est une cause majeure de maladie chronique du foie. Depuis 1989 et l’identification de ce virus, divers systèmes cellulaires ont été proposés pour l’étude du cycle viral in vitro. La plupart sont basés sur l’utilisation de réplicons sous-génomiques ou des virions produits en culture, combinés à des lignées de cellules isolées de carcinomes hépatocellulaires. Ils ne miment que partiellement l'infection naturelle. En 1998, nous avons été les premiers à démontrer une infection productive dans des hépatocytes primaires humains exposés à des sérums de patients chroniquement infectés. Deux récepteurs cellulaires majeurs impliqués dans l'entrée du VHC ont ensuite été identifiés : le récepteur aux LDLs et CD81. Le modèle associant des HHP et des virus natifs est le plus pertinent physiologiquement, mais la plupart des laboratoires ont échoué à l'utiliser. Aussi, nous avons récemment décrit des conditions optimales de culture et identifié des facteurs clés conduisant à une infection efficace des HHP par des sérums de VHC de différents génotypes. Ce modèle est essentiel pour l’étude des différentes étapes du cycle viral et pour déterminer l’efficacité de molécules antivirales. Il nous a permis d’identifier une souche de génotype 3a hautement infectieuse et d’établir le premier système cellulaire robuste pour l’étude de ce génotype in vitro. Nous étudions actuellement les effets induits spécifiquement par l’infection VHC de génotype 3 sur le métabolisme lipidique. Rôle de la voie de signalisation Wnt/β-caténine sur la fonction métabolique des hépatocytes L'organisation complexe du lobule hépatique dépend de nombreux paramètres dont les gradients d'oxygène et de molécules circulantes dans le sang, la composition de la matrice extracellulaire, les coopérations cellulaires et l’activation concertée de voies de signalisation. L’intégration de ces différents signaux intégrés est à l’origine de la zonation fonctionnelle des hépatocytes (et des autres types cellulaires du foie), et est principalement régulée par les voies de signalisation Wnt/b-caténine et APC (Adenomatous polyposis coli). La plupart de ces signaux sont perdus lorsque les hépatocytes sont extraits de leur niche naturelle et maintenus en culture. Nous avons récemment démontré que la voie de signalisation Wnt/β-caténine est un régulateur transcriptionnel des cytochromes CYP2E1, CYP1A2, et du récepteur AhR dans les HHP, tout comme elle régule leur zonation centro-lobulaire in vivo. L'analyse du transcriptome de HHP traités avec des inhibiteurs de la GSK3ß ou invalidés pour l'expression d’APC a révélé que cette voie pourrait également participer au contrôle de certaines fonctions essentielles de l’hépatocyte. En effet, les enzymes et les protéines impliquées dans l'homéostasie des acides biliaires, dans le métabolisme des lipides et dans la polarisation cellulaire sont dérégulées par ces traitements. De plus, le nombre, la structure et la fonctionnalité des canalicules biliaires sont affectés. Nous étudions donc le rôle de la signalisation Wnt/β-caténine dans la balance stéatose/cholestase dans les hépatocytes humains, afin d’identifier de nouveaux mécanismes de régulation de l’homéostasie des lipides et des acides biliaires et de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. 2. Différenciation de cellules souches/progéniteurs en hépatocytes Face à la difficulté d’approvisionnement en foies humains et à l'incapacité des hépatocytes humains à proliférer in vitro, nous étudions la capacité de sources cellulaires alternatives à se différencier en hépatocytes : les cellules souches embryonnaires humaines (hES) et les progéniteurs hépatiques (LPC). Lors d’une lésion hépatique chronique, lorsque la prolifération des hépatocytes est altérée, les LPC sont activés, migrent dans le parenchyme, formant la réaction ductulaire, et participent au renouvellement des cellules biliaires et des hépatocytes. Nous parvenons à isoler de façon reproductible à partir de la fraction non-parenchymateuse de foies humains sans insuffisance hépato-cellulaire une population épithéliale hétérogène comprenant des LPC. Cultivés dans des conditions adéquates, les LPC acquirent certaines fonctions de l’hépatocyte. Nous avons également établi un protocole de différenciation des hES vers l’hépatocyte, basé sur l'utilisation séquentielle de divers facteurs de croissance/cytokines et de matrice extracellulaire pour reproduire in vitro les différentes étapes de l'ontogenèse de foie. Toutefois, comme décrit par d'autres, nous nous heurtons au problème de la différenciation incomplète des hES et des LPC vers l’hépatocyte mature, suggérant que leur maturation terminale nécessite d'autres facteurs. Lors de la réponse régénérative après lésions hépatiques, le microenvironnement dans sa globalité, incluant tous les types cellulaires du foie et également des cellules circulantes (recrutement de macrophages et de cellules de la moelle), influence la prolifération et la différenciation des progéniteurs par la production de facteurs sécrétés localement, par l’interaction avec la matrice extracellulaire et via les interactions cellule-cellule. Ces réactions croisées permettent aux cellules de s'adapter et de synchroniser leur réponse afin d'éviter ou contenir les dommages et de rétablir l'homéostasie. Comprendre comment cet environnement dynamique particulier est affecté dans des situations pathologiques est d'une importance majeure afin d’identifier les candidats de cibles thérapeutiques. Pour répondre à cette question in vitro, nous étudions la réponse des LPC lorsqu'ils sont soumis à différents types de menaces, au cours de leur prolifération ou de leur différenciation. L’amélioration de ce modèle requiert l'intégration d'autres partenaires cellulaires dans des plates-formes de culture en 3D (scaffolds, auto assemblage en sphéroïdes) pour analyser et établir les bases moléculaires de leur coopération fonctionnelle lors de la prolifération/différenciation des LPC/hépatocytes. L’isolement et la caractérisation des différents acteurs de la niche hépatique, y compris les cellules stromales/souches mésenchymateuses (MSC), sont en cours.
3. Biothérapie des maladies du foie :
Une alternative à la pénurie d'organes pour la transplantation orthotopique du foie est l’infusion d'hépatocytes isolés dans l’attente d’un greffon ou d’une régénération spontanée. En étroite collaboration avec plusieurs départements du CHU Saint Eloi/Gui de Chauliac, nous développons actuellement un programme de biothérapie visant à transplanter des hépatocytes humains chez les patients souffrant d'insuffisance hépatique sévère (PHRC en cours, CHU St Eloi). Nous avons adapté notre protocole d'isolement pour préparer les hépatocytes humains selon les normes GMP. Dans ces conditions, nous isolons des hépatocytes de bonne qualité à partir de foies de donneurs d'organe très stéatosiques, réfutés pour la transplantation, et ce aussi efficacement qu’à partir de pièces d'hépatectomie. Nous avons défini des conditions de préservation à froid des hépatocytes humains en suspension permettant de maintenir leur viabilité et leur fonctionnalité pendant au moins 8 heures après l'isolement. La sécurité et la validation de ce procédé de conservation ont été démontrées par des expériences précliniques de transplantation dans un modèle murin de repeuplement du foie. Ce laps de temps permettra le transport des cellules du site de production vers le site d’injection, la préparation du patient et éventuellement des injections répétées. Le consensus actuel donne à penser que la nature des cellules à injecter dépend de la pathologie hépatique. La contribution significative de l'activité paracrine des MSC, plutôt que leur capacité à se trans-différencier, au processus de réparation du foie a déjà été établie dans un grand nombre de modèles pré-cliniques. Nous étudions actuellement cette approche dans un modèle expérimental d’hépatectomie large chez la souris. Références bibliographiques
Nous avons publié 29 articles dans des revues avec comité de lecture entre 2008 et 2014, et publié 27 documents en collaboration avec d'autres groupes français et étrangers, y compris des universitaires et des industries pharmaceutiques. - Marmier S et al. Novel role for ChREBP in the control of ethanol metabolism and susceptibility to binge drinking. Hepatology. 2015 Mar 11. doi: 10.1002/hep.27778. [Epub ahead of print] - Duret C et al. Cold-preservation of adult human hepatocytes for liver cell therapy. Cell Transplantation 2015 Jan 23. - Chapy H et al. PBPK modeling of irbesartan: incorporation of hepatic uptake. Biopharm Drug Dispos. 2015 Jun 3 - Vanessa Delfosse et al. Synergistic activation of human pregnane X receptor by binary cocktails of pharmaceutical and environmental compounds Nature Communication (in press) - Philippe Briolotti et al. 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Coordonnées
tel: 04 67 33 06 23 email: martine.daujat[a]inserm.fr Le groupe
Daujat-Chavanieu Martine (CR1/Inserm) Gerbal-Chaloin Sabine (CR1/Inserm) Gondeau Claire (Ingénieur/CHU) Duret Cédric (IE/Inserm) Briolotti Philippe (TCE/Inserm) Despeyroux Aure (Master 2) Da Silva Franck (Doctorant Cifre) de Boussac Hugues (Post doc/Inserm) Funakoshi Natalie (PHU/CHU) Herrero Astrid (PHU/CHU) Blanc Pierre (PU-PH/CHU) Larrey Dominique (PU-PH/CHU) Navarro Francis (PU-PH/CHU) Ramos Jeanne (MCU-PH/CHU) 
Mots-clés
Hépatocytes humains primaires Détoxication Métabolisme Cytochromes P450 Récepteurs nucléaires Virus de l’hépatite C Wnt/β-caténine Cellules souches embryonnaires humaines Progéniteurs hépatiques Différenciation Cellules stromales/souches mésenchymateuses Co-culture Culture en 3D Sphéroïdes Zonation fonctionnelle Biothérapie Techniques utilisées - Savoir faire
Biologie cellulaire: isolement et culture d’hépatocytes humains et des autres types cellulaires du foie (cellules endothéliales sinusoïdales, biliaires, Kupffer, progéniteurs adultes…), Infection des hépatocytes par le VHC, culture et différenciation in vitro de cellules souches embryonnaires humaines et progéniteurs hépatiques vers l’hépatocyte, co-culture, culture en sphéroïdes, encapsulation dans des microbilles d’alginate, culture sous flux.
Cytométrie en flux, techniques immunologiques (ELISA, Western blot). Cytologie: Immunofluorescence, Immunohistochimie. Biologie moléculaire: RT-qPCR, clonage. Imagerie: microscopie confocale. Modèle animal: hépatectomie large chez la souris. 
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